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免疫共沉淀实验流程
来源于:欧冠体育【中国】有限公司官网,浙江联硕生物科技有限公司 | 发布时间:2024/1/4 17:04:00

免疫共沉淀实验流程

通过免疫共沉淀确定未知结合蛋白

该实验的思路为:先通过免疫共沉淀实验,得到结合蛋白,随后对得到的结合蛋白进行测序。

用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1 ml冰冷的EBC裂解缓冲液中;

将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中,在微量离心机上4℃以最大速度离心15min;

收集上清(约30 ml)并加入30 μg的适当抗体,4℃摇动免疫沉淀物1 h;

加入0.9 ml的琼脂糖蛋白A悬液,4℃摇动免疫沉淀物30 min;

用含900 mmol/L NaCl的NETN洗琼脂糖蛋白A混合物,再重复洗5次。最后,用NETN洗一次;

吸出混合物的液体部分。加入800 μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中,煮沸4min;

将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中,在10mA的恒定电流下电泳过夜;

通过考马斯亮蓝染色观察蛋白质泳带;

从胶上切下目标带,将其放到微量离心管中,用1ml 50%乙腈洗两次,每次3 min;

用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质,再进行电洗脱;

通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽进行Edman降解测序。

*以上内容来自网络

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