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RNA提取原理与详细步骤
来源于:欧冠体育【中国】有限公司官网,浙江联硕生物科技有限公司 | 发布时间:2024/1/4 17:02:00

原理

用Trizol 的溶液提取,将总RNA与 DNA 和蛋白质分离。Trizol 是一种酸性溶液,含有硫氰酸胍 (GITC)、苯酚和氯仿。GITC 不可逆地使蛋白质和 RNase 变性。随后进行离心。在酸性条件下,总 RNA 保留在上层水相中,而大部分 DNA 和蛋白质保留在中间相或下层有机相中。然后通过用异丙醇沉淀回收总 RNA。RNase 酶可以通过加入吡咯碳酸二乙酯 (DEPC) 来灭活。

步骤

组织:每 100 毫克新鲜组织加入 1 毫升 TRIzol 试剂,使用无菌手术刀在冰上切碎,并用无菌匀浆器或其他设备匀浆。

细胞:如果是细胞培养物,应在从培养箱中取出后立即进行处理。细胞在室温(15-25 ºC)下以 1000rpm 离心5 分钟,然后丢弃上清液或从单层生长的细胞中去除培养基,用预冷PBS洗一次。每 1 × 10<7> 细胞加入 1 ml TRIzol 试剂。

1. 4°C 预冷离心机

2. 将组织或细胞裂解液转移到 1.5毫升无RNA酶EP管中。置冰上,静置 5 分钟。

3. 每管加入200ul氯仿,充分混合后冰上静置10分钟,使核蛋白复合物完全解离。

4. 在 4°C 下以 13000 rpm离心 15 分钟。期间,取一新EP管,加入500ul异丙醇,冰上预冷。

5. 离心后,将上层水相 (约500 ul) 转移到该新的 EP管中。

6. 冰上静置,酒精沉淀10min。

7. 离心, 13000 rpm, 10 分钟。

8. 去除上清液。用 1ml 75% 乙醇洗涤 RNA 沉淀一次。

9. 12000rpm离心 5 分钟。

10. 去掉上清,风干或真空干燥 RNA 沉淀 5-10 分钟。

11. 将 RNA 溶解在30-50ul DEPC 处理过的去离子水中(需根据RNA沉淀的量加水溶解)。

12. 进行分光光度分析以确定样品浓度和纯度。

*以上内容来自网络

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