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免疫荧光染色实验流程
来源于:欧冠体育【中国】有限公司官网,浙江联硕生物科技有限公司 | 发布时间:2023/12/21 17:23:00

一、 取材

1. 注意事项:预冷PBS,提前放入4℃冰箱1-2小时;4%PFA用1XPBS配制,通风橱恒温加热搅拌;灌流时尽可能灌流干净,洗净组织中的残留血液。

2. 步骤:

1) 1XPBS灌流

2) 内固定:灌流4%PFA

3) 外固定:将组织放入4%PFA溶液中48h-72h

4) 沉糖:30%蔗糖(组织沉底可切)

二、 冰冻切片

1. 注意事项:底座预冷10Min;涂OCT,切除小脑便于粘在底座上;全脑涂OCT,切片机冻大于2h,冰箱-20过夜;切片机提前预冷。

三、 免疫荧光染色

1. -20℃冰箱取片,室温晾干15min(复温);

2. PBS洗三次,每次5min

3. 抗原修复(可选步骤),5min 95℃水浴

4. 透膜 0.3%TritonX-100 5-10min (100mlPBS+0.3mL TritonX-100)

5. PBS洗3次

6. 封闭 :组化笔圈组织,5%BSA或5-10%FBS封闭1h(室温),37℃30min.

7. 擦干封闭液

8. 滴加一抗,4℃过夜(湿盒),一般16小时

第二天

9. 漂洗:PBS漂洗3次,每次10min

10. 敷二抗:稀释比例一般1:500,室温孵育2h,注意避光;也可37℃ 1小时

11. 漂洗:PBS洗3次,每次5min

12. 擦干,抗荧光淬灭封片液封片

四、 注意事项

1. TritonX-100配好后4℃保存可放很久

2. 冰箱-20℃取出后尽量不要太干

3. 染色过程尽量不要干片

 

*内容来自网络

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